Nos principaux projets portent sur la génétique des moustiques et la transgénèse des moustiques


Génétique chez le moustique


Les moustiques anophèles varient considérablement dans leur capacité innée à soutenir le développement du parasite du paludisme. La réponse antiparasitaire est extrêmement efficace dans plusieurs souches de moustiques génétiquement sélectionnés où le développement du parasite chez le moustique est bloqué tôt après l'infection (figure 1). Une question clé est donc de comprendre pourquoi certains moustiques sont résistants aux parasites du paludisme, alors que d'autres, au sein de la même espèce, favorisent le développement du parasite et transmettent la maladie. Lorsque nous avons commencé ce travail, la recherche de longue durée de facteurs génétiques contrôlant la résistance se limitait à la cartographie des intervalles contribuant à la résistance et, plus récemment, à l'identification des gènes candidats dans ces intervalles. Néanmoins, même lorsque ces gènes étaient polymorphes et lorsque les polymorphismes étaient corrélés avec la résistance des moustiques aux parasites du paludisme, il n'était pas encore clair si le polymorphisme du gène identifié était responsable de la résistance ou simplement lié à un polymorphisme de résistance voisin. Pour résoudre ce problème, nous avons conçu une nouvelle approche appelée interférence réciproque de l'ARN allèle-spécifique (rasRNAi), qui nous a permis d'évaluer la contribution de différents allèles du même gène à un trait donné (figure 2A).


Figure 1. Les facteurs génétiques contrôlent la résistance des moustiques aux parasites du paludisme. Les moustiques ont été infectés par P.berghei parasites exprimant GFP constitutivement et leur intestin moyen disséqué 8 jours plus tard. Les parasites sont visibles sur le mésogastre d'un moustique de la souche sensible (panneau supérieur, points verts). En revanche, les moustiques de la souche résistante sont dépourvus de parasites vivants (panneau inférieur). Au lieu de cela, les parasites tués sont encapsulés dans une capsule de mélanine dans cette ligne (petits points noirs).



Figure 2. TEP1 * R1 est plus efficace que TEP1 * S3 dans la destruction des parasites. (A) rasRNAi. Chaque boîte représente un gène. Avec l'utilisation de courtes sondes ARNdb spécifiquement dirigées contre * R1 (dsR) ou * S3 (dsS), chaque allèle TEP1 est réduit au silence séparément chez les moustiques F1 (boîte ouverte), nous permettant de comparer la fonction de chaque allèle dans le même contexte génétique . (B) Nombre de parasites dans la descendance F1 de L3-5 × G3 traités avec des sondes d'ARNdb spécifiques aux allèles et avec dsLacZ et dsTEP1 comme témoins négatifs et positifs, respectivement. Les moustiques exprimant seulement TEP1 * S3 (dsR) portent plus de parasites que ceux exprimant TEP1 * R1 (dsS) exclusivement, ce qui démontre que les polymorphismes au locus TEP1 contribuent à déterminer la résistance des moustiques aux parasites du paludisme. ** P < 0,001; ns, non significatif (modifié de Blandin et al. , 2009).



En utilisant la cartographie du génome des croisements de moustiques infectés par le parasite des rongeurs Plasmodium berghei, nous avons récemment démontré que les moustiques résistants et sensibles différaient dans une région majeure du troisième chromosome, appelée Pbres1 pour P. berghei locus de résistance 1 (19Mb). Fait à noter, l'un des gènes situés dans Pbres1 code le complément comme la protéine TEP1 (Fig 3), que nous avions précédemment caractérisé comme un gène antiparasitaire clé. En utilisant rasRNAi, nous avons montré que les polymorphismes dans le gène TEP1 qui est situé dans Pbres1, modulent l'efficacité de la destruction du parasite, identifiant ainsi le premier gène de caractère quantitatif (QTG) pour la résistance aux parasites du paludisme (figure 2B).


Figure 3. Structure cristalline et disposition des domaines de TEP1 * R1 par rapport au facteur complémentaire C3. Les différents domaines sont colorés. MG, domaine de la macroglobuline; LNK, éditeur de liens; TED, domaine thioester; ANK, ancre; la position de la liaison thioester (TE) est indiquée (modifiée de Baxter et al., 2007).



Cependant, une observation importante de notre travail était que le polymorphisme dans TEP1 ne tient pas compte de la variabilité observée dans la destruction des parasites, indiquant que des loci autres que TEP1 sont nécessaires pour rendre les moustiques complètement résistants à P. berghei chez les moustiques. Nous visons à disséquer davantage les réseaux génétiques complexes qui soutiennent la résistance des moustiques à P. berghei et P. falciparum dans des modèles de laboratoire d'infection et sur le terrain.

Avec les nouvelles possibilités offertes par les technologies à haut débit pour la cartographie fine des locus de caractères quantitatifs (QTL), et avec le test rasRNAi pour identifier précisément les gènes responsables dans les intervalles cartographiés maintenant, nous effectuons un écran de résolution fine pour identifier les composants génétiques contrôlant la transmission du parasite chez A.gambiae, et de comparer les réseaux génétiques régissant la résistance aux parasites du rongeur et du paludisme humain P.berghei et P.falciparum. Les gènes de résistance et les réseaux identifiés dans des conditions de laboratoire contrôlées seront testés dans le contexte de P naturel. falciparum en collaboration avec le Dr I. Morlais (IRD / OCEAC, Yaoundé, Cameroun). Notre objectif est d'identifier les gènes qui contribuent à la résistance à P.falciparum dans les populations naturelles, et d'étudier comment nous pouvons exploiter cette résistance naturelle aux moustiques contre les parasites afin de réduire la transmission du paludisme.




Transgénèse chez le moustique


La transgénèse Drosophila a permis de comprendre de nombreux aspects de la biologie de la mouche des fruits, permettant la surexpression du gène d'intérêt - de manière spécifique et temporelle grâce au système Gal4 / UAS et à ses raffinements-; la mutagenèse à médiation transposon pour la découverte de gènes clés des joueurs dans un processus biologique donné; l'expression de protéines d'intérêt fusionné à des journalistes tels que la protéine fluorescente verte (GFP) pour suivre leur destin cellulaire; manipulations génétiques fines telles que knock-out de gène; gène ciblé knockdown par ARNi transgénique ...

De même, on peut s'attendre à ce que la transgénèse aide à démêler les processus clés dans la biologie des anophèles, y compris celui des interactions vecteur / plasmodium. Ainsi, nous sommes particulièrement désireux d'exploiter la transgénèse d'Anopheles pour répondre à nos questions biologiques. À l'avenir, les moustiques transgéniques pourraient même aider à lutter contre le paludisme, car la transgénèse pourrait également être utilisée pour rendre les moustiques résistants aux parasites Plasmodium ou dans des stratégies visant à réduire les populations de moustiques vecteurs, comme la technique des insectes stériles.

Nous sommes intéressés à explorer le potentiel de tous ces aspects de la transgenèse des moustiques. Par conséquent, nous avons travaillé dur pour établir A.gambiae transgenèse dans notre laboratoire et sont maintenant capables de produire des moustiques transgéniques de façon routinière. Les facteurs clés de ce succès étaient l'optimisation de chaque étape de la transgénèse médiée par le transposon; la mise en place de lignes attP docking robustes pour la transgénèse médiée par le phage PhiC31 et la construction de plasmides auxiliaires efficaces; l'utilisation du tri larvaire automatisé pour distinguer les larves de moustiques transportant 0, 1 ou 2 copies d'un transgène donné afin de générer rapidement des lignées homozygotes stables et de surveiller la stabilité ultérieure du transgène; et l'utilisation de multiples marqueurs de sélection de transgénèse pour gagner du temps en générant simultanément plusieurs lignées transgéniques distinctes.

Avec ces outils à portée de main, nous sommes en train de (i) tester l'effet de divers transgènes sur les résultats d'une infection à Plasmodium; (ii) l'établissement d'une mutagenèse ciblée du génome de Anopheles gambiae en utilisant des endonucléases synthétiques TALEN; (iii) la mise en place de protocoles automatisés pour générer de grandes populations de moustiques porteurs des transgènes désirés, ou des populations de moustiques non sexuées ne portant aucun transgène. Les populations mâles pures obtenues de cette manière peuvent être utilisées dans des TIS ou dans des programmes d'intervention de remplacement de population, visant à augmenter la fréquence des moustiques résistants aux maladies dans la population générale des moustiques.

À l'avenir, nous explorerons plus avant comment la transgenèse peut aider à obtenir des moustiques mutants (mais non transgéniques) incapables de transmettre la maladie. Par exemple, apporter de petites modifications aux protéines de moustiques dont Plasmodium a besoin pour coloniser son vecteur pourrait rendre le vecteur résistant au Plasmodium. Les transgènes utilisés pour obéir à ces modifications génétiques peuvent être ensuite éliminés par des croisements génétiques et la sélection, et les lignées mutantes non transgéniques, résistantes aux maladies obtenues peuvent être évaluées pour des stratégies d'intervention de remplacement de population.




Les larves de moustiques transgéniques sont identifiées à l'aide de protéines fluorescentes (cyan, vert, jaune ou rouge) exprimées dans le système nerveux.


Nous avons appelé cette ligne transgénique "French kiss".


L'expression de divers gènes marqueurs dans des larves de moustiques transgéniques permet la sélection automatisée des génotypes désirés.



Un embryon d'Anopheles gambiae prêt à être injecté (photo: J. Soichot).



Fundings


Le groupe et ses membres bénéficient actuellement d'un financement de: INSERM, CNRS, FUTURE INVESTMENT, ERC, ANR, INFRAVEC, FONDATION POUR LA RECHERCHE MÉDICALE.